Mirar a ADSADN Mirar a Google

11/5/08

Lab Basics (3): Fotocopiant àcids nucleics (I)

A l'entrada anterior de la sèrie vam veure com obtenir DNA (i RNA) a partir de material biològic (cèl·lules en cultiu, sang). Ara que tenim les nostres cadenes de DNA resuspeses en un tubet amb líquid, què és el que podem fer amb elles?
Lamentablement poc, perquè aquest material que hem obtingut és el material genòmic complet de l'individu (poc pràctic per a treballar), i a més està poc concentrat. El més corrent és que a nosaltres ens interessi treballar amb una part de la seqüència d'aquest genoma, ja sigui en el gen o gens implicats en la nostra investigació o en una altra regió concreta no codificant.
Aquesta pretensió va poder convertir-se en realitat a les acaballes dels 70 quan, aplicant en laboratori els mecanismes de replicació del DNA inspirats en els que tenen lloc en la cèl·lula, es va dissenyar la tècnica de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) per a obtenir ingents quantitats del fragment de seqüència desitjat.

En la naturalesa i en el laboratori es parteix del mateix, posem de moment, ADN nuclear. El primer que en la cèl·lula ocorre per a replicar aquest material és separar ambdues cadenes de la molècula d'ADN, mitjançant enzimes helicases. Però separar els ponts d'hidrògen entre les bases nitrogenades de la cadena de DNA també es pot fer a altes temperatures, entre 90-98ºC (a més ponts d'H que calgui trencar, més temperatura). Això es diu desnaturalització.

Una vegada amb les cadenes separades, la síntesi de la nova molècula, còpia de l'original, es produeix en sentit 5'-3' de la cadena, i partint d'un fragment previ de cadena complementària a l'original que proporciona l'extrem -OH 3' lliure per a anar afegint nucleòtids. Aquests fragments en la cèl·lula els crea la primasa, i la síntesi de la cadena copia,l'enzima polimerasa.

Aquests petits oligonucleòtids inicials de cadena senzilla (encebadors, o primers) es creen en laboratori i es poden dissenyar a mà o amb programaris disponibles en internet i demanar a cases especialitzades (uns 12 euros cada oligonucleòtid de 20 parells de bases, que és el més usual, així que cada parella de complementaris et surt normalment per menys de 25 euros). Es dissenyen perquè siguin complementaris a un fragment de la regió d'interès i serveixin de base per a amplificar una i una altra cadena de la molècula motlle en ambdós sentits (en l'esquema de baix ho entendreu millor). Es lliuren liofil·litzats i es preparen per a utilitzar-los a una concentració final de 10-20 picomols per microlitre de reacció.
Per a unir-los a la cadena que vulguem copiar utilitzem també la temperatura: segons la seqüència de cada oligo aquesta temperatura d'hibridació varia entre 45-64 graus aproximadament(entre 50-58ºC és el més habitual). Com aquesta unió a les cadenes motlle només es produeix si ambdues seqüències són pràcticament idèntiques, ens assegurem que només copiarem la regió que nosaltres hem delimitat mitjançant el disseny dels nostres encebadors.

La síntesi de la cadena motlle la hi deixem a polimerases obtingudes de bacteris extremòfils, altament resistents i actius a les temperatures a les quals estem maltractant el DNA, i que amplifiquen la cadena normalment a 68-74ºC, segons la polimerasa. Una unitat d'enzim és aquella quantitat que converteix 1 mol de substrat per segon. La polimerasa es ven en tubs de 500 a 10000 unitats (500 unitats et poden costar entre 65-120 euros) i s'empra una concentració final de 1 unitat per microlitre de reacció.
Aquests enzims necessiten per al seu funcionament ions bivalents (magnesi normalment), que s'aporta en forma de clorur agregat o no a un tampó o buffer que manté un pH adequat per a la reacció. El tampó i el magnesi se sol vendre en kits juntament amb la polimerasa corresponent. I per suposat, es necessiten nucleòtids (desoxinucleòtids trifosfat o dNTPs), els maons necessaris perquè la polimerasa pugui anar construint la nova cadena còpia.

Així doncs necessitem per a la reacció una quantitat suficient de DNA còpia (50-100 ng és el més usual), que barrejarem en un tub en condicions d'esterilitat per a evitar barreges amb material genètic forà amb la parella d'oligonucleòtids, la polimerasa, el seu tampó i magnesi, nucleòtids i aigua destil·lada estèril i sense nucleases fins a un volum final de 25-100 microlitres.

Fixeu-vos que en un cicle d'amplificació que hem descrit (desnaturalització, hibridació, síntesi) per cada molècula motlle s'obtenen dues molècules noves (cadascuna amb una cadena motlle i una altra còpia). Mitjançant cicles successius d'aquesta reacció podem obtenir 2 elevat a n molècules de DNA del fragment que a nosaltres ens hagi interessat, on n és el nombre de cicles (30-40 és el més normal; més enllà la quantitat de DNA produït no és exponencial per esgotament dels productes de la reacció). I amb aquestes quantitats de DNA obtingut sí es pot treballar.

Antany tots aquests canvis de temperatura necessaris per als cicles d'amplificació els realitzava un operari canviant els tubs d'unes cubetas calentes a unes altres. Afortunadament de seguida es van emprar termocicladors, una espècie d'estufes amb temporitzador en les quals es pot introduir els tubs i programar el temps que vulguem que el termociclador escalfi o refredi per a cada fase del cicle. Un termociclador modern bàsic ronda els 6000 euros, encara que els hi ha molt més sofisticats.


Per a la desnaturalització se solen emprar pocs segons (mig minut o així); per a la hibridació, 30-40 segons haurien de ser suficients; el temps de síntesi depèn de la longitud que nosaltres vulguem amplificar (delimitada pels oligonucleòtids dissenyats): normalment una polimerasa típica amplifica 1000 parells de bases en un minut; se solen afegir alguns minuts extres, fora del cicle, perquè les cadenes deixades a mitjes s'acabin de sintetitzar, i finalment la reacció es para deixant els tubs a 4 graus.
O sigui, que en una hora i dos quarts o dues hores obtens 2 elevat a 35-40 molècules del teu tros de DNA desitjat en un tub (excepte la gent de la sèrie CSI, que ho obté en 1 minut escàs per exigències del guió).
La setmana que ve complementarem aquesta informació amb alguns altres detalls sobre la PCR i el que es fa després amb els tubs de reacció acabada.

Cap comentari: