Mirar a ADSADN Mirar a Google

14/12/08

Lab Basics (9): Fàbriques de proteïnes

Totes les tècniques de laboratori que hem estat explicant en les entrades anteriors del blog consisteixen en maneres d'aïllar, detectar, purificar, analitzar i modificar el material genètic segons els nostres propòsits. Sovint, la fi mateixa dels nostres experiments és aquesta, però sovint tota la feina anterior té com finalitat que aquest material genètic es tradueixi en proteïnes. Si volem seguir un procés metabòlic o una funció dins de la cèl·lula, necessitem la proteïna, no la recepta de com fer-la. La cèl·lula és la fàbrica en la qual es produirà la nostra proteïna d'interès, i ja vam veure com tenir el nostre hort de cèl·lules particular.

Introduir material genètic (per exemple, el nostre gen clonat en un vector bacterià) dintre de la cèl·lula no és senzill: els sistemes cel·lulars són impermeables al pas de material genètic forà com sistema de protecció contra els virus. El gran escull a salvar és la membrana citoplasmàtica (i en eucariotes, la nuclear).

Existeixen multitud de mètodes per a forçar a la cèl·lula a acceptar material genètic estrany. Un vector amb un gen clonat pot funcionar de forma autònoma (conté els seus propis orígens de replicació) o integrar-se en algun lloc del genoma. Sovint l'experiment requereix tan sols que la proteïna d'interès es tradueixi (24 o 48 hores és més que suficient): de l'extracte de cèl·lules es purifiquen la proteïnes. Un material genètic que no s'hagi integrat en el propi genoma de la cèl·lula, es perdrà en les successives divisions de la cèl·lula.
De vegades interessa seleccionar només les cèl·lules que hagin incorporat el vector d'expressió de forma permanent; per a això es tracten amb concentracions adequades de l'antibiòtic al qual el vector de clonatge és resistent. Moriran totes les cèl·lules que no hagin incorporat el vector en el seu genoma de forma estable. Però compte, la integració en el genoma del vector no és dirigida i per tant podem estar danyant la cèl·lula.
Perquè el nostre gen forà s'integri de forma permanent en un lloc concret del genoma que a nosaltres ens interessa es necessita una odissea de tècniques d'enginyeria genètica que no detallarem.

Una manera brava de permeabilitzar les membranes lipídiques és foradar-les amb detergents suaus o un xoc osmòtic, però hi ha alt risc de trencar-les. Altre sistema és embolicar el material a introduir en un agregat que la cèl·lula fagociti de forma natural. Si el vector a introduir és gran, es poden electrocutar les cèl·lules durant pocs segons per a foradar les seves membranes (electroporació). Les cèl·lules despolaritzen les seves membranes i es formen petits orificis pels quals penetren les molècules (proteïnes, ADN...). Fins i tot es pot disparar a les cèl·lules amb unes pistoles especials en les quals el material genètic s'uneix a una nanomolècul·la (sol ser or), a forma de balí que arribarà al nucli cel·lular.
Tots aquests procediments causen gran mortaldat en les cèl·lules.

Si volem que les nostres fàbriques de proteïnes siguin cèl·lules bacterianes (no sempre processen igual de bé les proteïnes de mamífer que les cèl·lules eucariotes però és fàcil tenir volums industrials de cultius), també es poden foradar les membranes per electroporació o xoc tèrmic, encara que són ceps de bacteris tractats prèviament amb productes químics a fi que la seva membrana sigui més susceptible a formar forats (cèl·lules competents, que es diuen).

Per a algunes aplicacions concretes, es microinjecta en la cèl·lula el que es desitja introduir (és la típica imatge de l'oòcit al qual se li punxa un espermatozoide). És extremadament delicat, difícil i costós i requereix una micropipeta que es controla amb l'ajuda d'un micromanipulador sota un microscopi. La mortaldat de les cèl·lules també és molt alta.

El més empleat avui dia és el sistema de lipofecció. Consisteix a embolicar el material genètic a introduir en una gavardina de molècules lipídiques amb càrrega positiva que tenen afinitat amb les membranes biològiques, de manera que s'acostin a la membrana i dipositin la seva càrrega dintre de la cèl·lula. Els compostos de lipofecció són cars (xifres de tres dígits) i cal assajar les condicions per a cada tipus cel·lular, però el protocol en si és senzill i ràpid.

Altra manera tan eficient o més que la lipofecció però també més perillosa per a l'investigador és utilitzar aquestes xeringues naturals que són els virus: virus modificats genèticament que continguin en el seu genoma el nostre gen d'interès, i facin les seves dolenteries perquè aquest material acabi dintre de la cèl·lula. És un procés mes llarg i complex però si les cèl·lules ho permeten, té una eficiència gens menyspreable. El treball en laboratori amb virus modificats requereix mesures extres de seguretat quan es tracta de virus que poden penetrar en cèl·lules de mamífer (adenovirus per exemple).

Forçar a una cèl·lula a fabricar ingents quantitats de la nostra proteïna d'interès suposa un estrès per a la fàbrica (com empresa turronera al desembre), que ha de destinar molts recursos a una proteïna que sovint li és estranya en comptes de dedicar-se a altres menesters. Malgrat que pugui semblar un sistema artefactual, ens hem de conformar perquè de vegades és l'única manera de poder estudiar en sistemes vius alguns processos.

Serveixin aquests breus comentaris per a il·lustrar la complexitat que un gen entri en una cèl·lula així com així: no només ha de traspassar unes membrana impermeables si no que a més, o s'integra amb ínfima probabilitat en el genoma o més val que formi part d'alguna estructura biològica que garanteixi la seva perpetuïtat i transcripció (cromosoma bacterià, virus). Petites menudencias que els gurús que ens adverteixen dels perills d'ingerir aliments que continguin gens malignes d'altres espècies no semblen tenir en compte. La transferència de gens horitzontal és comú en bacteris i segons la teoria endosimbiòtica ha succeït en eucariotes, però no passa d'aquí.

Cap comentari: