Mirar a ADSADN Mirar a Google

6/11/08

Lab Basics (7): Clitxant biomolècules (II)

A l'entrada anterior vam veure que l'ADN pot separar-se per grandària i vam avançar que aquesta mateixa estratègia (electroforesi) pot utilitzar-se per a separar i identificar altra mena de biomolècules. Abans d'anar per feina hem de comentar una altra tècnica molt utilitzada per a detectar la presència de cert fragment d'ADN concret enmig de molts altres. Després d'una electroforesi com la ja explicada, en la qual hem provocat que les molècules d'ADN es separin per mida, es pot transferir l'ADN des del gel d'electroforesi fins a una membrana de nitrocel·lulosa o nylon condicionada per a tal fi...: gel i membrana es posen en contacte, formant un sandwich entre capes de paper de filtre, encarregades d'absorvir un tampó iònic per capil·laritat i fer que l'ADN abandoni el gel i es quedi enganxat a la membrana. Posem aquesta membrana en contacte amb un líquid que contingui alguna cosa que s'uneixi a aquest ADN desitjat, que evidentment serà una seqüència complementària a la qual anomenarem sonda, i els nucleòtids de la qual estaran marcats d'alguna manera perquè després ens revelin la seva posició (amb isòtops radioactius, per exemple). Després podem exposar aquesta membrana a un film de fotografia en una càmera fosca, quedant gravat en el film un patró de bandes que després analitzarem, a la recerca del nostre fragment desitjat.



Aquesta tècnica la va desenvolupar un tal Edwin Southern i va passar a popularitzar-se com a Southern blot. Ràpidament es va aplicar aquesta mateixa estratègia a la detecció d'ARN: com els científics són la monda, van seguir amb els punts cardinals i van anomenar a aquesta tècnica Northern blot. S'utilitza sobretot per a esbrinar si es troba l'ARN derivat de l'expressió de cert gen en molts tipus diferents de teixits.

ADN, ARN, i falten les proteïnes per a completar la santíssima trinitat.

Les proteïnes es treuen a dojo trencant les cèl·lules: s'aplica una electroforesi en un gel especial que contingui una substància desnaturalitzant que trenqui l'estructura tridimensional de les proteïnes i les redueixi a la forma de cadenes d'aminoàcids: les milers de proteïnes presents en la cèl·lula es distribuiran per mida. Per a això no ens serveix una matriu d'agarosa: es requereix un gel d'acrilamida i unes cubetas d'electroforesi especials.



Les proteïnes es poden posar de manifest tenyint aquest gel amb colorants que es fixen a les proteïnes, com el Coomassie. Les proteïnes més abundants en la barreja donaran lloc a bandes de major intensitat.



Aquestes proteïnes es traspassen a una membrana, que s'incuba amb un anticòs específic que actuï de post-it natural i reconegui la nostra proteïna estimada i cap altra (per a evitar unions inespecífiques, les membranes es bloquegen amb alguna solució; en aquest cas sol ser llet, perquè les proteïnes de la llet s'uneixin a totes les regions lliures de la membrana i s'eviti que els anticossos s'uneixin a la babalà). Normalment és necessari retirar l'excés d'anticossos mitjançant rentats i tornar a incubar la membrana amb un altre anticòs, conjugat amb alguna molècula de la qual puguem obtenir alguna reacció bioquímica que es pugui detectar (fluorescencia és el més comú). En una cambra fosca es pot obtenir una impressió d'aquesta fluorescencia en un film. Per a continuar amb l'acudit, a això se li diu Western blot.

Per exemple, la imatge que segueix correspon a un western blot real. En el primer carril es veuen les bandes corresponents a una proteïna normal (hi ha dues bandes perquè la proteïna té dues formes de processament distintes, de mida diferent). Els altres carrils corresponen a aquesta mateixa proteïna però amb mutacions puntuals. L'últim carril correspon a aquesta proteïna mutada amb una deleció d'un fragment: veiem que la mida de les bandes, per tant, és més petita. La intensitat relativa de les bandes es pot quantificar, per a fer un càlcul aproximat de la quantitat de proteïna a la qual correspon.



I no existeix Eastern blot perquè la tríade ADN-ARN-proteïna ja està coberta (tret que a la Reina se li ocorri algun altre participant en l'origen de la vida).

Totes aquestes tècniques semblen fàcils d'explicar, però obtenir bons resultats amb elles és francament dificil i requereixen dos dias de feina, i fins i tot més. El que hem explicat aquí és tot just un esbós del procediment complet. A més són tècniques cares. Existeixen, per descomptat, derivacions d'aquestes tècniques, i molt altres processos similars de gran importància, però és impossible detallar-los tots.

Treball dur i delicat per a poder posar de manifest allò tremendament petit i invisible. Vull rendir un sentit homenatge a tots aquests científics (formats i en formació) que treballen durament en aquestes tècniques davant la incomprensió de la població general, a la qual esmentes que no et surten els westerns i pensen en alguna cosa com això:

Cap comentari: