Mirar a ADSADN Mirar a Google

2/6/08

Lab Basics (4): Fotocopiant àcids nucleics (II)

L'entrada anterior de la sèrie va descriure una de les tècniques mestres en els laboratoris de biologia mol·lecular (i d'altres) de tot el món: la PCR. Convé tenir bé clar el concepte perquè anem a comentar un parell de coses més al respecte.
Per exemple, ens vam centrar només en explicar com amplificar DNA. Què ocorre quan partim de mol·lècules de RNA purificat, que són de cadena senzilla? El procés en cadena descrit anteriorment era vàlid per a les mol·lècules de doble cadena. No hi ha problema: tornem a aplicar enzims disponibles a la natura per a solucionar-ho, en aquest cas la transcriptasa inversa (o retrotranscriptasa) vírica. No és més que una polimerasa particular que utilitza RNA com a motlle. El procediment per a amplificar RNA més comú és el següent: posem en el mateix tub certa quantitat de RNA purificat juntament amb seqüències curtes de moltes timines (poliT); aquests oligonucletids (...TTTTT...) s'hibridèn a alta temperatura (per a això utilitzem també un termociclador) amb la cueta d'adenines (---AAAA---) que tenen les mol·lècules de RNA sintetitzades en el nucli (cueta que les permet sortir al citoplasma per a la transcripció sense que les degradin). El paper de la poliT és anàleg al dels cebadors per a amplificar ambdues cadenes del DNA. Després de la hibridació amb les poliT, h'hia ha prou d'afegir a la reacció la trancriptasa inversa (més cara que la convencional) amb el seu respectiu buffer o tampó, nucleòtids i completar el volum amb aigua. Es deixa actuar la transcriptasa inversa (o reversa) a durant una hora a la temperatura adequada i s'obtenen com a resultat grans quantitats de molècules de cadena senzilla, equivalents al RNA inicial, però amb timina en lloc d'uracil. És a dir, similar al DNA de tota la vida però sense introns (seqüències no codificants) i de cadena senzilla. Aquesta molècula creada ex professo en laboratori es coneix com cDNA (DNA còpia), i és una manera immillorable d'obtenir una seqüència codificant de DNA (gen) sense presència d'introns, que es pot purificar i usar per a mil tècniques posteriors més (algunes de les quals explicarem d'aquí a poc). El cDNA obtingut pot servir al seu torn de base per a una amplificació convencional de DNA: en la primera reacció com és obvi només es pot amplificar la cadena que existeix, però la cadena senzilla vella formarà una doble cadena amb la nova i en les reaccions següents partim de la situació normal: molècules de doble cadena llestes per a amplificar.

Aquesta reacció descrita es diu RT-PCR (PCR de transcriptasa reversa), no confondre amb la PCR a temps real (Real Time PCR), sistema que serveix per a quantificar àcids nucleics (DNA i RNA). És una tècnica més complexa que requereix un termociclador especial, capaç de mesurar fluorescència. La idea és intercalar en la cadena de l'àcid nucleic una molècula que doni senyal fluorescent (fluoròfor), que es pugui detectar i quantificar i el senyal del qual sigui proporcional a la quantitat de producte de la PCR. Existeixen variacions i complicacions en la tècnica però el més habitual és detectar específicament una seqüència utilitzant oligonucleòtids marcats amb fluoròfors (sonda), que contenen el fluoròfor en un extrem i una mol·lècula segrestadora de la fluorescència del fluoròfor en l'altre (quencher). El contingut de la reacció de PCR és similar a l'habitual, també existeixen cebadors d'inici de l'amplificació. La sonda és complementària a un fragment de la seqüència diana, però la polimerasa amplifica a partir del cebador.


Quan la polimerasa es topi amb la sonda, separarà el fluoròfor de la resta de la sonda i es podrà detectar la seva fluorèscencia (lliure del quencher segrestador), que augmentarà exponencialment segons el nombre de còpies del DNA motlle.

Es poden usar vàries sondes amb fluoròfors diferents alhora. Per a la quantificació s'analitza la corba d'amplificació, que consta de 3 fases: una en la qual el producte encara no es pot detectar, la fase d'acumulació exponencial del producte i la fase de saturació de la reacció. El nombre de cicles necessaris perquè es produeixi un augment de fluorescència significatiu pel que fa al senyal basal (cicle llindar) és inversamente proporcional a la quantitat inicial de mol·lècules motlle. Mitjançant els càlculs pertinents (ja seria molt llarg explicar-ho) es pot obtenir una quantificació precisa del nombre de mol·lècules inicials en la reacció.



Us podeu fer idea de la sofisticació creixent d'aquest tipus de tècniques. Hi ha mil i una variants de la PCR, però no us torturo més.

Cap comentari: