Mirar a ADSADN Mirar a Google

25/4/08

Lab Basics (2): Purificant l'essència


La setmana passada vam explicar com es poden mantenir i criar cèl·lules animals en cultiu sense gaires problemes. Avui explicarem que a partir d'aquestes cèl·lules, i d'altres materials biològics, es pot destil·lar l'essència d'un individu: el seu material genètic.

Obtenir el DNA i el RNA d'una mostra és el primer pas per a desenvolupar moltes altres tècniques: identificar l'individu, seqüenciar o clonar un gen, i dur a terme altres indagacions. El punt de partida és disposar de material biològic susceptible de contenir material genètic, que equival a dir que serveix qualsevol cosa que contingui cèl·lules nucleades.

Purificar DNA a partir d'una mica de sal·liva, arrel d'un pèl, semen, etc, com solem veure en les sèries de genètica forense, no és la situació més òptima en els laboratoris d'investigació perquè purificar el material genètic d'una mostra tan pobra és més complicat i menys eficient, i es necessita material específic més car.

Per a obtenir realment de forma senzilla, barata i quantiosa el millor és partir de sang (congelada o fresca) o cèl·lules en cultiu, obtingudes a partir d'una biòpsia com vam explicar la setmana anterior. En el cas de la sang, les cèl·lules nucleades són les cèl·lules del sistema inmunitari que circulen per la sang: els glòbuls vermells i plaquetes han de ser descartats per centrifugació. En el cas de la biòpsia, sol ser de pell i no hi ha problemes per obtenir cèl·lules amb nucli. Si es tracta de cèl·lules bacterianes, els bacteris han d'haver crescut surant en un tub amb medi líquid, i ens estalviem haver d'accedir dintre d'un nucli.

En centrifugar les cèl·lules (tantes com puguem disposar) i endur-se el medi de cultiu queden reduïdes a un grumoll de petita grandària (pellet). Com el que ens interessa (el material genètic) està en el nucli, hem d'arribar fins a ell. Per a això trenquem la membrana exterior de les cèl·lules amb solucions alcalines que contenen detergentes que "lisen" les cèl·lules, centrifuguem per a descartar aquesta brosseta i trenquem la membrana dels nuclis que estan per allà solts amb una solució similar. Així, tots els "budells" de les cèl·lules queden solts en el tub.

Com normalment ens interessa obtenir el DNA i l'altre àcid nucleic que està per allà pul·lulant (el RNA) ens interfereix, ens ho carreguem afegint una solució que conté uns enzims que es carreguen el RNA (ribonucleases, o RNAses). Després de deixar-les actuar (a 37ºC com gairebé tots els enzims que funcionen en el cos), hem de lliurar-nos del següent que ens molesta en el nostre poti-poti: les nombrosíssimes proteïnes que formaven part de la cèl·lula. Podem aconseguir que precipitin en forma de mucositat blanca i densa afegint una solució alcalina, sovint acompanyada d'altres substàncies que trenquen l'estructura proteica. Després de centrifugar, el pellet contindrà el material de deixalla "pesada" (restes de membranas, proteïnes, guarrerides) i en la fracció líquida, el que ens interessa, el DNA en restes líquides, que es trasllada a un tub net.

Per a seguir netejant aquest DNA de sals i guarrerides ho tractem de forma seqüencial amb alcohols de diferent tipus: isopropanol, i etanol de més a menys concentrat, que fa que la molècula de DNA precipiti en forma de fils blancs que poden ser visibles fins i tot a ull nu. Centrifugant i fent evaporar l'etanol, obtenim aquests fils aïllats, que conservarem resuspesos en aigua destil·lada pura i estèril o un altre tampó de conservació, en la nevera o un congelador. L'aspecte no és més que un petit tub amb una ínfima quantitat de líquid transparent dintre, però amaga la informació genètica d'un individu sencer.

Totes aquestes solucions i materials poden comprar-se sense problemes com kits de purificació, que contenen tot el material i instruccions necessàries per a 50 o 100 reaccions i solen passar dels 100 euros.


Quan es necessita un DNA extraordinariament purificat se sol intercalar un pas extra, que és el de fer passar la barreja líquida obtinguda a partir del lisat de nuclis per un cilindret de plàstic que conté una membrana especial de silicagel, que té la propietat de retenir el DNA i deixar passar les altres porqueries. Els rentats amb etanols poden seguir produint-se sense que el DNA se separi de dita columneta. Després, amb simple aigua o tampó podem el·luir el DNA fins al tub definitiu. Gràcies a aquest pas per la columna de purificació la mostra resultant és molt més pura i ens assegurem que quedin menys restes.

El cas de RNA és bastant més complicat, perquè és un àcid nucleic que es degrada amb mirar-ho i requereix més miraments. S'ha de partir de sang fresca (recent obtinguda i sense coagular) o cultiu fresc. La lisi cel·lular i solubilitat del RNA es duu a terme amb sals de guanidina, detergents i solucions reductores que es carreguen les proteïnes i inhibeixen les RNAses a més de promoure que el RNA s'uneixi a la columna de purificació. La contaminació per DNA pot resoldre's mitjançant enzims DNAses o es perd amb la resta d'impureses. Usarem guants i material tractat especialment perquè les RNAses presents arreu no interfereixin.

Aquests protocols bàsics poden encara ser modificats a fi de garantir més puresa o millorar l'eficiència de purificació. Com comprovar l'estat del material genètic obtingut i quines altres manipulacions podem dur a terme? Això ho veurem en els següents capítols de la sèrie...

Cap comentari: