Mirar a ADSADN Mirar a Google

31/10/08

Lab Basics (VI): Clixant biomolècules (I)

Qualsevol persona curiosa que estigui una mica interessada en la biologia molecular pot arribar a preguntar-se...com saben els científics si en un tubet hi ha ADN, sinó es veu a primera vista ni amb els microscopis més senzills, i en aquest tub no sembla haver-hi res més que aigua?
I després d'haver explicat tècniques com la de la PCR, com podem saber, si no veiem res a primera vista, que tenim milions de còpies del fragment que volem i de cap altre?
Doncs és perquè, encara que sembli mentida, és la mar de fàcil separar l'ADN per grandària i detectar-lo aprofitant algunes particularitats químiques d'aquesta molècula tan amigable.

Recordeu que la molècula de ADN està composta per un esquelet de sucres pentosa, grups fosfat i una successió de bases nitrogenades (components dels nucleòtids). La càrrega de l'ió fosfat és negativa. Això significa que, com qui no vol la cosa, la càrrega elèctrica global de la molècula d'ADN és negativa. Si aquesta dada la relacioneu amb el que us van explicar a l'escola sobre camps elèctrics, deduireu que si sotmeteu l'ADN a un camp elèctric, per un fenomen de repulsió la molècula es desplaçarà a la zona positiva del camp. Recordeu també la dada que l'ADN té una estructura una mica rígida de doble cadena. Si introduïm l' ADN en una matriu porosa, que serà el suport que sotmetrem al camp elèctric, la molècula es mourà amb més o menys facilitat en funció de la seva longitud total, la grandària del porus de la matriu i el voltatge del camp elèctric. És a dir, que tenim una sèrie de variables per a discriminar la grandària d'una molècula d'ADN. És el que es coneix com tècnica d'electroforesi.
La matriu porosa a la qual ens referim es forma amb agarosa (un pols extret d'algues) dissolta en cert volum d'una solució salina (que proveirà els ions necessaris perquè existeixi el camp elèctric), escalfada i posteriorment solidificada: segons el % final de agarosa (normalment 0,8-2,5% per cent) tindrem una matriu sòlida d'un polímer amb una grandària major o menor de porus. A menor grandària de porus, millor discriminarem fragments petits d'ADN, que s'aniran repartint per la matriu en funció de la seva longitud doncs a mateix voltatge elèctric, els fragments curts es desplaçaran més ràpid cap al pol positiu i els fragments llargs quedaran retinguts. Si necessitem una grandària de porus molt menor, la agarosa no ens serveix però disposem d'un altre polímer, l'acrilamida.



Per a poder introduir l'ADN en la matriu o gel, es fa polimeritzar o solidificar la matriu amb una pinta que fabrica uns petits pouets a un dels costats: allà es carregarà un cert volum de la nostra dilució d'ADN barrejat amb glicerol (que farà que l'ADN pesi i caigui al fons del pouet) i uns colorants blaus que també es desplaçaran pel gel i ens avisaran de si tot funciona bé i de quan les molècules corren el risc de sortir-se de la matriu per l'altre costat com si d'un vaixell víking en arribar a la fi del món es tractés.


La matriu de agarosa s'introduïx en una cubeta plena del tampó iònic: aquesta cubeta té un born negatiu i un altre positiu: les mostres d'ADN es carreguen en el costat negatiu perquè recorrin la matriu cap al costat positiu. La cubeta es connecta a una font de voltatge (70-120 V usualment) durant un temps determinat (30 minuts o fins i tot hores) en funció de la grandària prevista dels nostres fragments d'ADN.


Un cop pensem que els fragments d'ADN ja han pogut distribuir-se per la matriu, s'atura l'electroforesi i es pot detectar l'ADN gràcies a una molècula que s'intercali entre les dues cadenes (present en la barreja de càrrega o submergint la matriu en ella): habitualment sol ser bromur d'etidi però existeixen alternatives menys perilloses (el bromur d'etidi també s'intercala en LES NOSTRES cadenes d'ADN i és per això que tot el material en contacte amb bromur d'etidi queda fatalment marcat com potencialment cancerígen). En incidir la llum UV en el bromur (amb uns aparells anomenats transil·luminadors) , emet fluorescència rosada. Això és el que podem descobrir en il·luminar amb UV una matriu de agarosa després de l'electroforesi:

De la qual cosa podem fer una foto o treure'n una imatge:


El primer carril respon a un marcador de pes molecular, això és: una barreja de fragments de ADN de grandària coneguda, que ens serveixen com a referència. Els següents carrils corresponen a les mostres que volíem comprovar. Imagineu que havíem volgut amplificar per PCR un fragment de cert gen a partir de mostres de 6 persones diferents. Hi ha vuit tubs perquè un d'ells ens ha servit com a control negatiu, això és, una barreja de PCR sense ADN per a comprovar que no existeix contaminació i que vam amplificar només el ADN que vam introduir en el tub. En fer una electroforesi després de la PCR, carregant el marcador i les vuit mostres d'esquerra a dreta, podem concloure que:

a) La nostra PCR no s'ha contaminat.
b) Hem amplificat el fragment que volem i cap altre (perquè comparant amb les bandes del marcador, el fragment que surt marcat en els carrils té la grandària que nosaltres volíem). Si veiéssim bandes estranyes d'altres mides, sabríem que no tenim el nostre ADN amplificat suficientment purificat!!!
c)L'ADN de la persona corresponent al carril 2 no s'ha amplificat: alguna cosa va fallar en aquesta reacció. ADN en mal estat? Error en el procés?
d)L'ADN de la persona corresponent al carril 4 no s'ha amplificat tant com les altres, hi ha menys concentració, perquè a igual volum carregat, la banda té menys intensitat. ADN en mal estat? Mal quantificat? Error en el procés?

Com veieu, podem extreure bastant informació.
La banda de agarosa amb ADN dins es pot retallar, recalentar, separar l'ADN de la agarosa i purificar l'ADN, per si volem recuperar el nostre fragment favorit i purificar-lo, per a seqüenciar, per exemple.
Distintes variants de l'electroforesi es poden aplicar per a separar fragments d'ADN amb diferent finalitat, però no les detallarem totes.
En la següent entrada, no obstant, veurem que la mateixa filosofia es pot utilitzar per a separar proteïnes i ARN, amb una altra sèrie de tècniques tan universals que mereixen una entrada a part.

Cap comentari: