Mirar a ADSADN Mirar a Google

11/10/08

Lab Basics (5): Analitzant seqüències

Perdó per trigar tant! No us penseu que anàvem a deixar sense acabar la sèrie divulgativa. Havíem deixat les mostres d'ADN congelades a -20ºC graus una temporadeta, i ara podem continuar treballant amb elles.
Per si no us enrecordeu, en la nostra entrada anterior, havíem explicat cóm obtenir moltes còpies d'una regió concreta de l'ADN a partir d'una mostra molt menys concentrada, gràcies a la tècnica de la PCR.
Normalment, quan hom manipula seqüències d'ADN (amplificant-les, o tallant-les, com veurem en una entrada posterior), és que li quedi la sospita de si la seqüència resultant s'ha mantingut idèntica a l'original, sense que s'hagi introduït o perdut algun nucleòtid en alguna de les reaccions, o les enzimes polimerases s'hagin equivocat a l'hora de copiar la cadena d'origen. A vegades passa el contrari: hem amplificat una seqüència amb uns cebadors que pretenien introduir cert nucleòtid mutat a la nostra conveniència i volem saber si realment aquest canvi desitjat està present a les mol·lècules filles.
Per assegurar-nos que la nostra seqüència és la desitjada, recorrim a la tècnica de la seqüenciació.
Actualment, aquesta técnica consisteix en realitzar una amplificació per PCR en un termociclador normal, partint d'una certa quantitat de l'ADN que es desitja "llegir", una polimerasa especial i una barreja de nucleòtids modificats, alguns dels quals estan marcats amb fluorescència (o terminadors): cadascún d'ells (A, T, C, G) marcats amb una fluorescència distinta. En aquesta reacció d'amplificació, a diferència de les habituals, no es fa servir una parella de cebadors per seleccionar la regió concreta que es desitja amplificar, sinó només un dels cebadors (millor si en un tub es fa servir el cebador complementari a una de les cadenes, i en un altre, el complementari a la cadena contrària, per comprovar que els resultats de les dues són equivalents).
El cebador s'uneix a la regió complementària i la polimerasa comença a amplificar la regió d'interès. Quant incorpora uno dels nucleòtids marcats, no es pot seguir ellongant aquella cadena i la seqüència queda troncada. De forma ideal, al final del procès tindrem tantes cadenes de mida escalonada com bases nucleotídiques teníem a la cadena que volíem copiar.
El protocol de temps i cicles és una mica diferent al de la PCR normal, però la base del procès és la mateixa.
Una vegada fet això, es precipiten i netejan les mostres obtingudes de la PCR per eliminar sals i restes de terminadors; això por fer-se netejant l'ADN amb etanols a diferent concentració o filtrant-lo amb unes resines especials. Una vegada net i resuspès convenientement, es fa passar per un seqüenciador.
Aquest equipament no sol estar disponible als laboratoris corrents, així que és freqüent portar les mostres a una unitat especialitzada que cobra per fer-ho. Allà disposen de robots seqüenciadors automàtics que poden seqüenciar moltes mostres d'una sola vegada: separen les molècul·les d'ADN per mida després de passar-les per un capil·lar i detecten la fluorescència que emet l'últim nucleòtid incorporat. Després enregistren el resultat en forma de gràfic de pics de colors (convencionalment, T vermell, G negre, C blau i A verd), anomenats cromatogrames, de forma que veient la succesió de pics es pot llegir la seqüència que ha passat pel capil·lar (existeixen programes informàtics específics).



A dalt: Dues figures esquematizant el procès general de seqüenciació automàtica.
A sota: cromatograma i detall d'una seqüència de pics.

Mitjançant un altre software, comparem la seqüència obtinguda amb la seqüència de referència, que és la que volíem obtenir. Així podem detectar incongruències entre les dues seqüències, detectar errors, comprovar si s'han introduït els canvis que volíem, etc.
La longitut màxima d'una seqüència que es pot llegir bé, sense que els pics sortin deformats, sol ser de fins a 1500 parells de bases.
Per exemple, volíem buscar mutacions a cert gen, responsables d'una malaltia hereditària en un pacient. Obtenim ADN genòmic del pacient, amplifiquem en diferents fragments tot el gen per PCR i seqüenciem aquest fragments. En un dels cromatogrames corresponent a un d'aquests fragments, veiem un canvi d'una A per una G respecte a la seqüència de referència: en aquesta posició hi ha dos pics perquè la mutació es trobaria en heterozigosi, és a dir: en un dels cromosomes la seqüència és correcta; a l'altre, està present aquesta variació. Normalment aquesta canvis es tradueixen en canvis a nivell de proteïna. Mutació habemus.

Cap comentari: