Mirar a ADSADN Mirar a Google

7/1/09

Lab Basics (10): Pinta i coloreja (cèl·lules)

Finalitzem aquesta sèrie de divulgació explicant una de les tècniques més espectaculars que s'apliquen en biologia molecular: la microscopia per fluorescència, o com distingir les diferents parts de la cèl·lula o localitzar proteïnes o trossos de seqüència marcant-les amb colors.

La tècnica més corrent és la de inmunofluorescència, o marcatge per anticossos. Les cèl·lules en cultiu poden inmobilizarse fixant-les amb metanol o paraformaldehid al portaobjectes de microscopia on s'han deixat crèixer, o deixar-les vives i funcionant en plaques especials que permetran realitzar les labors de microscopia respectant les necessitats ambientals de la cèl·lula. Fer putades a les cèl·lules mentre les mantens vives és difícil perquè cal conservar les condicions òptimes de pH, temperatura, intercanvi de gasos...mentre lluïxen davant les càmeres. Per això el més habitual és fixar-les amb una solució que mantingui fixa les seves estructures i les deixi "congelades". A continuació s'apliquen tractaments de permeabilització de la membrana perquè entrin els anticossos.
Marcant amb anticossos proteïnes específiques de cada orgànul cel·lular o utilitzant altres molècules que s'uneixen a proteïnes o lípids, podem localitzar tots els compartiments de la cèl·lula: membrana, mitocondris, reticle endoplasmàtic...així com localitzar la nostra proteïna d'interès (podem saber si està repartida per tot el citoplasma, es concentra en el nucli, es localitza en la membrana...etc).
Els anticossos es produïxen en animals de granja (rata, ratolí, ovella, cabra, i de vegades pollastre, cavall, ruc...) injectant la proteïna exògena i dessagnant posteriorment l'animal. Normalment s'usa primer un anticòs que detecta la proteïna i després un anticòs secundari que detecta al primer i que està unit a una moléclula que emet fluorescencia (fluoròfor). Una bateria d'anticossos secundaris amb diferent marcatge, desenvolupats en animals diferents als de l'anticòs primari, forma part de l'equipació de qualsevol microscopista.

En la següent imatge casolana, el nucli cel·lular està tenyit amb DAPI (emet fluorescència en l'espectre del blau), els lisosomes estan detectats amb un anticòs conjugat amb un fluoròfor en verd i el reticle endoplasmàtic, marcat en vermell.



És important que els espectres de fluorescència de les diferents regions marcades no es solapin (un marcatge ha de ser en l'espectre del verd i altre en el del vermell, per exemple). La colocalització d'una proteïna marcada amb un color amb un orgànul marcat amb altre color es posa de manifest pel color de la fluorescencia resultant (per exemple, si vermell i verd colocalitzen es percep fluorescencia groga).



Les mateixes tècniques es poden aplicar en corts de teixit.


Altra alternativa, en comptes de preocupar-nos dels anticossos, és fusionar la proteïna d'interès a una altra que emeti fluorescencia, com vam anticipar en una entrada anterior. És el cas de les famoses proteïnes de fusió derivades de la Green Fluorescent Protein (GFP), obtinguda a partir d'una medusa que emet de forma natural fluorescència i que per mutagènesi ha permès desenvolupar variants de diferents colors (vermella, groga, blava...). Transfectant les cèl·lules amb aquest vector, fabricaran la nostra proteïna d'interès que durà penjant el petit fanalet de la proteïna fluorescent, la qual cosa ens permetrà també localitzar la seva posició o valorar la interacció amb altres proteïnes.
Fixeu-vos si és important aquesta tècnica que els investigadors que la van desenvolupar han guanyat el Premi Nobel de Química el 2008.

També es pot afegir a la nostra proteïna d'interès qualsevol altra seqüència contra la qual puguem dirigir un anticòs o alguna molècula que reaccioni i permeti la seva detecció. En definitiva, el que volem és utilitzar l'enginyeria genètica o el marcatge natural per anticossos per a posar-li una banderola detectable a la nostra proteïna.
Finalment, mitjançant sondes (seqüències d'ADN complementàries a la nostra seqüència d'interès) fluorescents o radioactives, podem localitzar el nostre gen en un conjunt de cromosomes. Una aplicació típica és la detecció de trisomías a nivell prenatal(si hi ha tres punts de color en comptes de dos, és que tenim una còpia extra d'aquest gen!).



I tot aconsellant un passeig per alguna galeria d'imatges de microscopia professionals per a descobrir el que donen de si aquestes tècniques, concluim la nostra sèrie de deu entrades resumides que pretenien explicar, de forma superficial, algunes de les tècniques més comunes i utilitzades en els laboratoris de biologia molecular. Després de la succinta descripció s'amaguen tècniques cares i llargues de realitzar, que sovint comporten dificultats tècniques gens menyspreables, però que en tot cas són de comuna aplicació i conegudes per la major part de científics. Serveixi això com apropament a una professió summament desconeguda, complexa, frustrant i alhora creativa i gratificant (quan el teu esforç es tradueïx en el resultat esperat!!).

Cap comentari: