Lab Basics (8): Talla-i-enganxa: dissenya el teu propi clon

A les persones fàcilment impresionables, tendents a simplificar la complexitat dels organismes vius amb un "això ha de ser cosa d'un déu que ho dissenya i ho organitza tot", els ha de resultar intrigant que els científics moleculars anem tot l'estona parlant dels àcids nucleics i les proteïnes com si fossin boles de plastil·lina, o blocs de Lego, fàcils de manipular al nostre antull. Però no s'ha d'oblidar que són molècules i que els humans ens limitem a utilitzar propietats químiques i lleis físiques que ens hem trobat donades: és ciència i no màgia que els enllaços atòmics puguin trencar-se en certes condicions i formar-se en unes altres. Ens limitem a aprofitar-nos d'això.

En 1975, Nathans i Smith van descobrir que els bacteris produïen uns enzims molt curiosos per a protegir-se de l'ADN forani (viral) susceptible d'atacar el seu material genètic: les endonucleases o enzims de restricció. Aquestes proteïnes actuen com autèntiques "tisores moleculars", capaces de tallar l'esquelet fosfat de la doble cadena d'ADN sense danyar les bases nitrogenades. Premi Nobel al cant: la enginyeria genètica estava en marxa, més coneguda com "això ho trec d'aquí per a posar-lo allà perquè m'interessa més", o, per als respectuosos de les jerarquies divines, jugar a ser Déu.

Els enzims de restricció són proteïnes que poden ser purificades de cultius a nivell industrial dels bacteris que les produïxen, i que donen nom a l'enzim en qüestió: EcoRI (I. coli cepa RI) per posar un exemple arquetípic. N'hi ha centenars d'elles comercialitzades amb preus variables (de 20 euros a 200 en funció de la raresa i concentració). L'ADN bacterià està protegit dels seus propis enzims per presentar grups metil (-CH3). Els diferents enzims de restricció no tallen l'ADN a l'atzar, sinó perquè s'uneixen a ell després de reconèixer una seqüència concreta (diana de restricció). En cas contrari no tallen gens. Les dianes solen ser seqüències cortetes i els trossos d'ADN resultants poden tenir extrems roms o amb fragments de seqüències protuberants. Un extrem protuberant d'una cadena d'ADN "A" pot unir-se a un extrem protuberant amb seqüència complementària de la cadena d'ADN "B", que és la gràcia del tema.



Els enzims requereixen per a actuar unes condicions especials, per tant el procés de digestió que té lloc en el tub ha de donar-se posant en contacte el ADN que es desitja tallar amb els enzims d'interès, un tampó amb ions apropiats i la temperatura idònia per l'enzim (habitualment, 37ºC), i deixar que les tisores tallin durant una o més hores.
Un batalló d'altres proteïnes col·laboren en els processos d'enginyeria genètica: lligases (la cola necessària perquè els fragments d'ADN tallats puguin tornar-se a unir), polimerases especials que tallen extrems protuberants i els tornen roms, altres proteïnes que impedeixin que un fragment digerit torni a unir-se sol...Un maletí de manualitats posat al servei del teu propi disseny de material genètic.

Podeu entretenir-vos comprovant que qualsevol seqüència és susceptible de contenir dianes de restricció inventant-vos una seqüència en un buscador de dianes aquí.

Del que hem après en les entrades anteriors de la sèrie podem deduir quins són els procediments habituals: es purifiquen els ADN d'interès, s'amplifica la regió concreta que desitgem tallar i pegar; els fragments d'ADN digerits poden diferenciar-se per electroforesis; podem purificar aquest ADN i disposar de la seva seqüència per a buscar les dianes de restricció que contingui i triar els enzims de restricció adients. Tallem els fragments desitjats i els podem unir entre sí, unint molècules d'ADN de diferent procedència. Engantxem els fragments i aquest ADN es pot introduir en una cèl·lula perquè es repliqui normalment (bacteriana o eucariota depenent de les modificacions que després vulguem que tingui la proteïna).

El més habitual és que les víctimes de tots aquests processos siguin els propis bacteris. A un bacteri al qual se li ha introduït un fragment de material genètic procedent d'altre organisme se li diu "clon" (a distingir del que la majoria de la gent entén per "clonació"). A nivell comercial disposem de cromosomes bacterians circulars modificats (vectors) que contenen una regió rica en dianes de restricció perquè sigui fàcil tallar i pegar el nostre gen d'interès, amb regions que permetin que aquest gen s'expressi en bacteris o cèl·lules eucariotes, i altre gen que produïxi una proteïna amb propietats antibiòtiques de manera que puguem matar els bacteris que no han introduït aquest vector clonat i ens quedem només amb els amables bacteris que contenen el nostre vector i resisteixen a l'antibiòtic, a part de contenir el nostre gen i/o produir la nostra proteïna d'interès.



També podem tallar i pegar el nostre gen al gen que codifiqui una proteïna fluorescent de manera que quan es fabriqui la nostra proteïna, porti penjant un fanal lluminós que ens indiqui on està (això ho veurem en una entrada posterior).
La llista d'aplicacions industrials, farmacèutiques i científiques és enorme: produccion d'anticossos, proteïnes d'interès humà (producció d'insulina per a diabètics, per exemple), generació de vacunes (com la de l'hepatitis), modificació genètica de plantes i animals (és la base dels transgènics!!), teràpia génica, i aplicacions en medicina forense.

No obstant això, la producció industrial per bacteris modificats genèticament de molècules per a consum humà té molt mala premsa arrel del tràgic cas Showa Denko, en el qual a les acaballes dels 80 van morir 38 persones i més de 1500 van quedar seriosament afectades per consum d'un suplement dietètic (L-triptòfan) produït per bacteris modificats al que no se li van realitzar els deguts controls sanitaris; els grups contraris a la comercialització d'aliments transgènics ho tenen com exemple preferit i més letal dels perills de la manipulació genètica. Vaja, és que no n'hi ha gaires més que hagin estat letals...I no, la malaltia de les vaques boges no és un exemple d'efectes nocius derivats de la manipulació genètica, perquè és una malaltia infecciosa, produïda per prions.