Mirar a ADSADN Mirar a Google

12/10/08

De Nobels, GFPs, luciferases i altres fluorescències

Com ja sabeu, aquest any el Premi Nobel de Química ha estat atorgat a tres investigadors els treballs dels quals van permetre descriure i aplicar la proteïna verda fluorescent (GFP).

Oligodendròcit. Wikimedia commons

Científics guardonats

  • Osamu Shimomura, per ser el primer en descriure la proteina que feia fluorescent la medusa Aequorea victoria. Entrevista telefònica
  • Martin Chalfie, per ser el primer en utilitzar-la en biomedicina. Entrevista telefònica
  • Roger Y. Tsien, per descriure els aminoàcids essencials per a la fluorescència de la proteina, el que va permetre, a ell i a altres grups, mutar-la per variar el color de la seva fluorescència. Entrevista telefònica


Neurones piramidals. Imatge de l'article de PLoS, de Wei-Chung Allen Lee i col·laboradors. Via Wikimedia commons

Tan important és una proteina de medusa que la fa brillar en tons verds? Doncs sí. L'aplicació d'aquesta proteina als camps de la biomedicina ha permès realitzar estudis que abans, o bé eren cars o difícil de dur a terme, o bé no es podien ni arribar a somiar. A part del seu innegable us científic (15163 artículos a dia d'avui contenen "GFP" al PubMed), l'us d'aquestes proteines està generant tota una sèrie d'imatges d'una bellesa difícil de creure. Pel canvi en els mètodes d'estudi biomèdics que ha suposat, s'ha comparat la seva aplicació amb la creació del microscopi; per la fantàstica qualitat artística d'algunes de les imatges que s'han obtingut, jo el compararia amb el Hubble.

Mètode d'us

La proteina GFP està codificada pel gen de la GFP. Els gens són seqüències de DNA. Les tècniques d'ingenyieria genètica permeten treballar cada cop més fàcilment amb aquestes seqüències de nucleòtids.

No tot el DNA està format per gens; existeixen seqüències de DNA que o codifiques per a cap proteina, és a dir, no es transcriuen a RNA, ni, per tant, es tradueixen a proteina. El DNA que es troba enganxat a l'inici d'un gen acostuma a controlar l'expressió d'aquest. Com ja vàrem dir a Back to the future, aquestes seqüències són les regions reguladores, els interruptors que "diuen" quan, com, on i en quina quantitat es produirà la proteina codificada per aquest gen en concret.


Arrel d'Arabidopsis.Wikimedia commons

Si posem la GFP davant d'una d'aquestes seqüències, la proteina verda s'expressarà als mateixos llocs, moments i amb les mateixes quantitats que els que s'expressaria el gen controlat per aquesta regió reguladora. És a dir, si volem conèixer on s'expressa una proteina, podem generar un animal transgènic en el que haguem introduit la GFP davant la regió reguladora del gen problema. Les cèl·lules que brillin verdes seran les que l'expressin.

Un altre us. La GFP, i els seus derivats, es poden unir a anticossos. Recordeu que els anticossos són proteïnes que reconeixen específicament determinats antígens. Actualment existeixen varis mil·lers d'anticossos comercials, cadascun d'ells capaç de reconèixer una porció de proteina en concret. Si posem anticossos amb GFPs aquests s'uniran a les proteines específiques i "brillaran" senyalitzan la seva situació. Així, podem obtenir "fotos" de cèl·lules amb regions intracel·lulars tenyides de diferents colors (un per a cada proteina reconeguda per cada anticòs marcat).

Estructura 3D de la GFP. A la dreta, GFP "tallada" per deixar veure el fluoròfor. Wikimedia commons

És possible separar poblacions de cèl·lules amb aquestes proteïnes?

Si combinem aquest "marcatge" en diferents colors, amb un aparell anomenat "Citòmetre de flux", podem fins i tot, separar poblacions de cèl·lules. Intentaré explicar-ho. Al citòmetre de flux es col·loca la mostra, formada per una suspensió de ilions de cèl·lules que volem separar. Imagineu que, per una banda volem cèl·lules que expressin tan sols una proteina que, mitjançant anticossos, hem marcat en verd; mentres que a l'altra població volem cèl·lules que tan sols expressin una proteina que hem marcat en vermell; les cèl·lules que no tenen aquestes proteines, o que tenen les dues, no ens interessen. Tot això, per a què? Doncs, per exemple, per aconseguir poblacions aïllades de mastòcits (un tipus concret de glòbuls blancs) i de macròfags (uns altres glòbuls blancs).


Tub de mostres al citòmetre de flux.Wikimedia commons

El citòmetre te un capil·lar per on va passant la mostra. Aquest capil·lar te un gruix tal que tan sols hi pot passar una cèl·lula. Sobre el capil·lar hi incideixen làsers que van anal·litzant cadascuna de les cèl·lules. Depenent del color en el que brillen les cèl·lules s'activa una palanca que va dirigint la gota que conté aquesta cèl·lula cap a un tub o un altre. I tot això a una velocitat de vertígen! Veure-ho en acció és tota una experiència.

Usos sofisticats de la GFP

I aixi, fins arribar als usos més sofisticats d'aquestes proteines. Existeix una meravollasa pàgina sobre la proteina GFP de Marc Zimmer, en la que podeu trobar moltíssima informació sobre aquesta proteina. En aquesta pàgina existeix un apartat (Cool uses) en el que es mostra alguns dels usos més espectaculars:
  • Brainbow. Vàrem parlar d'aquesta meravella quan va ser publicat el treball fa un any, a l'entrada El tresor al final de l'arc de Sant Martí. Un ratolí transgènic al que se li han inserit gens per a diferents proteïnes fluorescents que, gràcies a la tecnologia Cre/lox (mireu l'entrada), han permès pintar cada neurona d'un color. Un any després, sorprenentment, tan sols 2 articles del PubMed contenen notíces sobre aquest "Brainbow". Em resulta realment estrany ja que crec sincerament que pot revolucionar la neurologia. Potser és massa informació per un any... o és poc aplicable.

  • Entre les varietats de "pinta i coloreja" amb GFP, són realment espectaculars els animals ab els ulls pintats de verd

  • Porcs de pota "groga". Veurer per creure.

  • El moviment de les neurones. En aquest vídeo es veu marcada l'actina, component del citoesquelet cel·lular, per poder seguir el creixement "fil·lopòdic" de l'extrem d'una neurona. What amazing!



Granota d'ulls "brillants".Wikimedia commons

A aquests usos se'ls hi hauria d'afegir altres de més "creatius", com els llimoners-fanals que vem comentar a Llimones de baix consum.

No es GFP tot el que llueix

Per acabar, vull retre'ls-hi el merescut homenatge a altres eines "fluorescents" dels biòlegs.

La Luciferasa
.
Un gen de les cuques de llum, entre d'altres animals "brillants". Ai! Quins records! Quants experiments introduint la luciferasa clonada davant de l'"interruptor" de la MKP-1 (una proteina a la que vaig acabar agafant estima, no us preocupeu) en cèl·lules que després tractava per veure els canvis en la seva expressió. Sento la frase enrevessada, però un també te el seu petit orgull...

De fet, aquest és un altre dels usos de les proteines fluorescents: si vols saber com altera l'expressió d'un gen un fàrmac en concret (si, si, molts fàrmacs produeixen canvis en l'expressió dels gens), pots posar una proteina fluorescent davant l'"interruptor" d'aquest gen i afegir diferents concentracions del fàrmac per després mesurar la fluorescència. A més fluorescència, més s'expressarà el gen.

Representació 3D de la luciferasa. Wikimedia commons

Una aclaració, la luciferasa no és fluorescent. De fet, la luciferasa és un enzim que fa que un reactiu, la luciferina, brilli.

Fluoròfors
La fluoresceïna (verda), la rodamina (vermella), la cianina (blava), i altres, són compostos amb lluentor pròpia també emprats en el marcatge de proteïnes.

Cap comentari: